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細胞計數(shù)方法：從計數(shù)板到全自動細胞計數(shù)儀

許多常見的實驗和檢測需要科學家首先準確計算細胞的數(shù)量或密度。這些操作包括簡單的細胞培養(yǎng)維護（如細胞傳代）以及定量實驗（如qPCR）。細胞計數(shù)可以通過多種方法完成，本文將全面介紹這些方法及其優(yōu)缺點。

1 計數(shù)板/血細胞計數(shù)器

使用血細胞計數(shù)器時，首先用70%酒精和鏡頭紙清潔計數(shù)器，然后將蓋玻片輕輕放置在計數(shù)板上。如果正確放置蓋玻片，可以觀察到牛頓環(huán)現(xiàn)象（同心環(huán)狀的彩色圖案）。用移液器取一小部分細胞懸液，將移液器放在計數(shù)板邊緣，讓懸液通過毛細作用流入計數(shù)室。如果需要檢測細胞活性，應在加入計數(shù)室前將臺盼藍以1:1比例混入細胞懸液中。

血細胞計數(shù)器是最早專門用于獲取準確細胞計數(shù)的方法，計數(shù)板上有特殊的網格。通常，大方格為1毫米×1毫米，并被進一步分為0.05毫米×0.05毫米的小格子。計數(shù)室的邊緣設計為將蓋玻片固定在標記網格上方0.1毫米處，從而形成已知體積的區(qū)域。

顯微鏡聚焦到計數(shù)室的一個區(qū)域后，使用計數(shù)儀對細胞進行計數(shù)。通常采用1平方毫米（100納升）的區(qū)域，并使用4倍或10倍物鏡計數(shù)，但具體選擇取決于細胞大小和懸液中的密度。此過程通常會在四個不同的1平方毫米區(qū)域重復，結果取平均值。如果檢測細胞活性，應分別計數(shù)活細胞和死細胞，其中由于膜受損，死細胞被臺盼藍染色為藍色。

圖1 血細胞計數(shù)板網格的示意圖

優(yōu)缺點

手動計數(shù)是節(jié)約預算的方法，但也是最耗時且繁瑣的。由于人為誤差，特別是連續(xù)進行多次計數(shù)時，可靠性較低。此外，頻繁計數(shù)還可能導致眼部疲勞。如果實驗室只需偶爾計數(shù)，并且不需要高精度，那么血細胞計數(shù)儀是一個不錯的選擇。但在需要頻繁計數(shù)、提高精度或高通量應用時，這種方法顯得不足。此外，手動計數(shù)難以區(qū)分懸液中不同類型的細胞，除非細胞類型在大小或形狀上有顯著差異。

2 自動細胞計數(shù)儀

自動細胞計數(shù)儀是手動計數(shù)的快速、簡便且自動化的替代方案。它們基于與血細胞計數(shù)儀相同的原理，通過在已知區(qū)域內多次計數(shù)細胞并取平均值來完成操作。這些設備也能通過臺盼藍等染料排除法區(qū)分活細胞和死細胞。自動細胞計數(shù)儀可以是獨立設備，也可以連接到計算機使用。大多數(shù)計數(shù)儀除了提供細胞計數(shù)外，還能統(tǒng)計細胞大小等信息。

熒光細胞計數(shù)儀（例如 Luna-FL™ 雙熒光細胞計數(shù)儀）可區(qū)分活細胞和死細胞，并使用常見的染色劑（例如吖啶橙和碘化丙啶）進行細胞計數(shù)。這些類型的細胞計數(shù)儀在計數(shù)可能被非細胞碎片（例如原代細胞）污染的培養(yǎng)物中的細胞方面也表現(xiàn)出色，因為染料可以清楚地區(qū)分細胞。

優(yōu)缺點

自動計數(shù)儀適合通用的細胞計數(shù)和活性檢測。它操作簡單、成本較低，大大減少了手動計數(shù)的勞動量。自動計數(shù)儀精確可靠，但在計數(shù)形狀不規(guī)則、非常小、懸液極為稀薄或包含多種需要區(qū)分的細胞時可能存在挑戰(zhàn)。對于大多數(shù)細胞類型和應用，自動計數(shù)儀提供了高效的計數(shù)性能。

3 Coulter計數(shù)儀

Coulter計數(shù)儀并非光學儀器，而是通過測量微通道的電阻變化來計數(shù)細胞。細胞的電阻高于懸液電解質溶液，當細胞通過通道時會短暫增加電阻，這一變化隨細胞大小增加而增大。Coulter計數(shù)儀的操作類似于自動計數(shù)儀，但使用前需先運行空白測試，并在使用后進行設備沖洗。

優(yōu)缺點

庫爾特計數(shù)儀速度快，能準確計數(shù)不同大小的細胞，因此常用于醫(yī)院的血細胞計數(shù)。然而，它無法區(qū)分活細胞和死細胞，也無法準確計數(shù)形成團簇的細胞。此外，其維護要求較高。

4 流式細胞儀

流式細胞儀通常用于更詳細的細胞分析，配備熒光檢測技術，可檢測標記的細胞內成分。并非所有流式細胞儀都能進行細胞計數(shù)，但具備體積測量功能的流式細胞儀可提供高度準確的細胞計數(shù)，并可通過熒光標記的抗體區(qū)分細胞類型。

優(yōu)缺點

流式細胞儀功能強大，但價格昂貴，通常在$40,000至$100,000以上，因此很少用于常規(guī)細胞計數(shù)。

5 其他細胞計數(shù)方法

光譜測定偶爾用于估算細胞密度。由于細胞具有渾濁性，隨著細胞密度增加，透過比色皿的光線減少。然而，由于光譜儀并未直接計數(shù)細胞，僅測量吸光度，并且懸液中其他變量可能影響吸光度，因此這種方法并不可靠。

培養(yǎng)法是另一種計數(shù)方法，僅適用于形成菌落的細胞（如細菌）。細胞懸液經過稀釋并劃線至培養(yǎng)皿后，計數(shù)菌落數(shù)目以計算原始懸液的細胞密度。但由于需要等待菌落生長，培養(yǎng)法是最慢的方法。

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